匙葉翼首草 （Ｐｔｅｒｏｃｅｐｈａｌｕｓｈｏｏｋｅｒｉ （Ｃ．Ｂ． Ｃｌａｒｋｅ）Ｈｏｃｋ．）屬川續(xù)斷科（Ｄｉｐｓａｃａｃｅａｅ）翼首花 屬（Ｐｔｅｒｏｃｅｐｈａｌｕｓ）的一種藏藥材，藏語音譯為榜 孜毒烏、榜子毒烏、榜孜奪吾等，在“南派藏醫(yī)藥” 中被喻為地 上“七 種 仙 草”之一。《中 國藥 典》 ２０１５年版收 錄，記 載 其 味 苦，性 寒，有小毒，具 有 解毒除瘟，清熱止痢，祛風通痹的功效；還收錄如 十 二 味 翼 首 散、潔白丸等含翼首草的藏藥復方制劑。

１ 材料與方法

１．１ 試驗材料

供試種子采自西藏巴宜區(qū)百巴鎮(zhèn)扎 地 村，由 西藏農(nóng)牧學院食品科學學院蘭小中教授鑒定為川 續(xù)斷科翼首草屬匙葉翼首草 （Ｐｔｅｒｏｃｅｐｈａｌｕｓ ｈｏｏｋｅｒｉ （Ｃ．Ｂ．Ｃｌａｒｋｅ）Ｈｏｃｋ．）。 供 試 菌 株 為 Ｃ５８Ｃ１（ｐＲｉＡ４），由 重慶 市 甘 薯 工 程 技 術 中 心 保 存與惠贈。 供 試 儀 器：高 效 液 相 色 譜 儀 （島 津，ＬＡ２０ 型）；ＰＣＲ儀（Ｂｉｏ－Ｒａｄ，Ｃ１０００型），DHG-9070A鼓風干燥箱（上海精宏試驗設備有限公司）；電子分析天平（上海越平科學儀器有限公司，ＪＡ２００３型），全自動高壓蒸汽滅菌鍋（ＭＬＳ－３７８０型，日本日立）；齊墩果酸 與熊 果 酸 標 準 品 （９８％，美 侖 生 物 公 司），甲 醇 （ＨＰＬＣ 級，Ｈｏｍｅｙｗｅｌｌ 公 司 ）。 ＭＳ、１／４ ＭＳ、 Ｂ５、１／２Ｂ５、ＷＰＭ 等 培養(yǎng) 基（青 島 海 博 公 司）；超 純水（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，明 澈－Ｄ２４ ＵＶ）；其 余試 劑 為 分 析純。 供 試 引 物：ｒｏｌＢ Ｆ ５′－ＧＣＴＣＴＴＧＣＡＧＴ－ ＧＣＴＡＧＡＴＴＴ－３′， ｒｏｌＢ Ｒ： ５′－ＧＡＡＧＧＴＧ－ ＣＡＡＧＣＴＡＣＣＴＣＴＣ－３′；ｒｏｌＣＦ：５′－ＴＡＡＣＡＴＧ－ ＧＣＴＧＡＡＧＡＣＧＡＣＣ－３′，ｒｏｌＣ Ｒ：５′－ＡＡＡＣＴＴ－ ＧＣＡＣＴＣＧＣＣＡＴＧＣＣ－３′（上海英駿公司合成）。

１．２ 試驗方法

１．２．１ 農(nóng)桿菌活化與培養(yǎng)

２８ ℃在 ＹＥＰ 平板（利福 平４０ｍｇ·Ｌ－１）劃線培養(yǎng)，２ｄ。挑 取 單 菌 落 于１ｍＬ ＹＥＰ（利 福平 ４０ｍｇ·Ｌ－１）培養(yǎng)基，２００ｒ·ｍｉｎ－１，２８ ℃過夜培 養(yǎng)，取１ｍＬ菌液擴大培養(yǎng)５０ｍＬ，ＯＤ６００吸光度為 ０．５～０．６時，室溫下４０００ｒ·ｍｉｎ－１，離心１０ｍｉｎ， 然后 ＭＳ重懸液（含乙酰丁香酮 ２０ｍｇ·Ｌ－１）重 懸，在上述條件下培養(yǎng)３０ｍｉｎ后可用于轉化。

１．２．２ 發(fā)根的誘導

采用葉盤法，將翼首草無菌苗的葉片 在 超 凈 臺剪成０．５～１．０ｃｍ 的葉段。在 ＭＳ重懸液中浸 染８、１５ｍｉｎ。轉接至 ＭＳ固體培養(yǎng)基（含乙酰丁 香酮２０ｍｇ·Ｌ－１），分別暗培養(yǎng) １、２ｄ后轉移至 ＭＳ固體培養(yǎng) 基（含 頭 孢 噻 肟 鈉２００ｍｇ·Ｌ－１）， ２５ ℃，黑暗培養(yǎng)，每周更換１次培養(yǎng)基 直 到 獲 得 無菌的發(fā)根。

１．２．３ 發(fā)根檢測

取新 鮮 發(fā) 根 ０．５ ｇ，用 ＣＴＡＢ 法 提 取 總 ＤＮＡ，作為 ＰＣＲ 檢測模 板。２５μＬ 體 系：ｄｄＨ２Ｏ ２０μＬ，１０× ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ（含 ＭｇＣｌ２ ）２．５ μＬ， １０ｍｍｏｌ·Ｌ－１，ｄＮＴＰｓ０．５μＬ，上 下 游 引 物 各 ０．５μＬ，模 板 ＤＮＡ ０．５μＬ，Ｔａｑ ＤＮＡ 聚 合 酶 （５Ｕ·μＬ－１）０．５μＬ。９５℃ 預變性５ｍｉｎ；９４℃ 變性３０ｓ，５５℃退火３０ｓ，７２℃延伸１ｍｉｎ，３０個 循環(huán)；７２ ℃，８ ｍｉｎ。１％的瓊脂糖凝膠進行電泳 鑒定。

１．２．４ 不同液體培養(yǎng)基培養(yǎng)

將除菌完成的翼首草發(fā)根分別接種０．２ｇ于 ８０ｍＬ的１／２Ｂ５、Ｂ５、ＷＰＭ、ＭＳ、１／４ ＭＳ液體培 養(yǎng)基（蔗糖均為３０ｇ·Ｌ－１，ｐＨ 調(diào)至５．８，３個 重 復），在恒溫搖床中１１０ｒ·ｍｉｎ－１，２５ ℃，黑 暗培 養(yǎng)２個月。在４０℃烘箱烘干，研缽磨細。取發(fā)根 的根尖１ｃｍ 于各固體培養(yǎng)基上，２５ ℃，黑暗培養(yǎng) １個月。

１．２．５ 齊墩果酸與熊果酸的提取

齊墩果酸與熊果酸的提取方法參考《中國藥 典》２０１５年 版，準確 稱 取０．２００ｇ翼 首草 發(fā) 根 干 粉，加入３０ｍＬ 甲醇，在超聲清洗儀以８０％功率 清洗３０ｍｉｎ，濾紙過 濾 后 于４０ ℃烘 干，５ｍＬ 甲 醇溶解，過０．２２μｍ 濾膜，４ ℃保存?zhèn)溆谩?１．２．６ 色譜條件 島津 ＯＤＳＣ１８色譜柱（４．６ｍｍ×２５０．０ｍｍ， ５μｍ）；流動相：甲醇－０．１ｍｏｌ·Ｌ－１：乙酸銨溶液 （８５∶１５），流速１．０ｍＬ·ｍｉｎ－１；檢測波長２１０ｎｍ；柱溫箱３５ ℃；近樣體積１０μＬ。

２ 結果與分析

由于翼首草的葉片為草質(zhì)且?guī)в泻芏嘞倜?共培后易感染菌，所以確定一個合適的共培與浸 染時間對于優(yōu)化翼首草發(fā)根誘導較為重要。共培 養(yǎng)１ｄ浸染８ｍｉｎ效果較好，誘導率為１２％。隨 著浸染時間與共培時間增加，翼首草葉片的受損 與長菌的幾率增加如表１所示。

以 Ｃ５８Ｃ１（ＰＲｉＡ４）為陽性對照，能擴增出ｒｏｌ Ｃ（６２６ｂｐ）與ｒｏｌＢ（４３２ｂｐ）基因，陰性對照以水為模板，沒 有 擴 增 出 條 帶。以２個 根 系 ＤＮＡ 為 模板進 行 ＰＣＲ，可 以 檢 測 到ｒｏｌＣ、ｒｏｌＢ 基 因ＭＳ培養(yǎng)基為營養(yǎng)富集型培養(yǎng)基，其 無 機 鹽 濃度較高，各元素比例均衡，營養(yǎng)豐富，微量元素 較為全面，是目前應用較廣的培養(yǎng)基。１／４ＭＳ培 養(yǎng)基為 ＭＳ培養(yǎng)基大量元素濃度的１／４，無 機 鹽 濃度較低，為低無機鹽培養(yǎng)基。Ｂ５培養(yǎng)基為硝酸鉀高 培 養(yǎng) 基，銨 態(tài) 氮 含 量 低。 翼 首 草 發(fā) 根 在 １／４ＭＳ中生長速度最快生物量最大，其 中 鮮 質(zhì) 量 達９．２１０ｇ、干質(zhì)量達０．５２９ｇ，但毛狀根有類似愈 傷組織、較松散成團狀，顏色較白，含水量較高，其 次 為 Ｂ５ 培養(yǎng)基鮮質(zhì)量達 ５．２７０ｇ、干 質(zhì) 量 達 ０．３８５ｇ，１／２Ｂ５的生物量最小干質(zhì)量僅０．２４２ｇ。 在５種固體培養(yǎng)基上以 Ｂ５與１／４ＭＳ生長最快， ＷＰＭ 培養(yǎng)基生長較慢長勢較差，從 生 物 量 上 可 以看出，翼首草發(fā)根在固體與液體培養(yǎng)基生長情 況基本一致。

３ 討論

翼首草的毛狀根因為葉片表皮具有腺毛等附 屬結構易殘留農(nóng)桿菌，需控制浸染時間與共培時 間，該試驗以共培養(yǎng)１ｄ，浸染８ｍｉｎ的效果最好。 不同的培養(yǎng)基由于化學成分和各組分比例不同，對翼首草發(fā)根的生長、次生代謝產(chǎn)物合成具有影 響。ＭＳ為植物基本培養(yǎng)基具有無機鹽濃度較 高，硝 酸 鹽 含 量 高，銨 鹽 含 量 較 高 （ＫＮＯ３ １９００ｍｇ·Ｌ－１、ＮＨ４ＮＯ３６５０ｍｇ·Ｌ－１）的特點； １／４ＭＳ培養(yǎng)基為 ＭＳ培養(yǎng)基大量元素減少到１／４，具 有無機鹽濃度較低的特點；Ｂ５培養(yǎng)基的主要特點是 含有較低的銨鹽（其中 ＮＨ４ＳＯ４１１３ｍｇ·Ｌ－１），較高 的硝酸鹽（ＫＮＯ３ ２５００ ｍｇ·Ｌ－１）；１／２Ｂ５為 Ｂ５培養(yǎng)基大量 元 素 減 半；ＷＰＭ 培養(yǎng)基為木本植物 培養(yǎng)基（其 中 Ｃａ（ＮＯ３）２ ·４Ｈ２Ｏ５５６ｍｇ·Ｌ－１， ＮＨ４ＮＯ３４００ｍｇ·Ｌ－１）。